Il patrimonio della biblioteca, costituitosi nel corso dei secoli grazie ai doni e ai lasciti dei professori dello Studio e aggiornato in forza del diritto di stampa e di acquisti mirati, deve buona parte del suo nucleo storico, con speciale riferimento ai manoscritti e agli incunaboli, all’incameramento ottocentesco dei fondi provenienti dalle soppresse librerie claustrali.

I manoscritti sono 2738, risalenti ai secoli XI-XX, in prevalenza di argomento storico e teologico, ma sono rappresentate anche letteratura, filosofia, giurisprudenza, medicina e matematica.

Tra i più importanti il De civitate Dei di s. Agostino, appartenuto al vescovo Ildebrandino Conti, che presenta un distico composto dal Petrarca e scritto di suo pugno, proveniente dalla biblioteca degli eremitani di Padova.

Nell’ambito della storia veneta segnaliamo l'Itinerario, autografo di Marin Sanudo, che descrive il viaggio compiuto nel 1483 con i sindaci di terraferma attraverso il dominio veneziano, corredato da disegni a penna di città e castelli, pervenuto dalla biblioteca benedettina di S. Giorgio Maggiore di Venezia.

Preziosi i frammenti musicali, tramandati da alcuni codici del monastero benedettino di S. Giustina, che attestano il ruolo di Padova nella produzione arsnovistica di fine Trecento-primo Quattrocento.

Di grande interesse il fondo settecentesco di disegni navali, che testimonia l’evoluzione della progettazione e delle tecniche di costruzione delle navi nell’ultimo secolo della Repubblica veneta.
Tra i manoscritti recenti, importante il fondo costituito dalle carte del filosofo Roberto Ardigò, il maggiore rappresentante del positivismo italiano, docente all’Università di Padova.

La prima produzione a stampa è documentata da 1.132 edizioni del Quattrocento, alcune in più copie, per complessivi 1.583 incunaboli.
Segnaliamo l’esemplare della novella Ippolito e Leonora, databile al 1471, con la nota manoscritta che ha permesso di assegnare l’edizione a Lorenzo Canozi da Lendinara, primo stampatore in Padova.
Pregevoli gli incunaboli decorati. Citiamo l’esemplare del De re militari del Valturio (Verona 1472): al ricco corredo xilografico si aggiungono le miniature ed importanti interventi calligrafici, recentemente attribuiti alla mano di Felice Feliciano.

Ricordiamo anche i volumi di Matteo Bosso, stampati su pergamena e miniati (Firenze 1491 e Bologna 1495), e quelli finemente decorati da Antonio Maria da Villafora, come l’esemplare delle Epistole di S. Paolo (Parigi 1499).

Si contano 9.622 cinquecentine e oltre 100.000 edizioni dei secoli XVII-XVIII: grande importanza rivestono in particolare le opere di medicina e di astronomia.
Va citato il first folio di Shakespeare, l’opera omnia stampata postuma a Londra nel 1623, estremamente rara nelle biblioteche europee fuori d’Inghilterra.

Tra le edizioni di pregio si ricordano in particolare la Gerusalemme liberata del Tasso (Venezia 1745), illustrata dal Piazzetta, e i capolavori tipografici di Giambattista Bodoni.

Tra i fondi notevoli si segnalano i libri armeni, prodotti per lo più dalla tipografia dell'isola veneziana di S. Lazzaro, e i libri ebraici, provenienti per la maggior parte dalla raccolta Morpurgo.

Importante la dotazione relativa alla stampa periodica nazionale ed estera: in particolare il nucleo costituito dai periodici dell’ancien régime e la serie delle pubblicazioni accademiche, tra cui le raccolte complete del Journal des savants e delle Philosophical Transactions della Royal Society londinese. Le testate possedute sono 6681, di cui 592 correnti.